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다중 막관통 타깃 단백질 개발 기술 플랫폼

Transmembrane Proteins Platform
배경
그림 1. 다중 막관통 단백질
                    그림 1. 다중 막관통 단백질
막관통 단백질은 세포막의 인지질 이중층에 내장되어 세포 내부와 외부의 스패닝을 구현하는 단백질의 일종으로, 막관통 영역의 상호작용은 막 외부 환경과 내부 환경을 연결시키는 중요한 통로이자 다양한 활성화 및 응답 반응을 통해 신호전달을 수행하여 세포 내부 및 외부의 형태 및 기능적 변화를 조절합니다. 많은 인간의 질병은 비정상적인 막횡단 단백질 기능과 관련이 있을 수 있으며, 막횡단 단백질의 다양성으로 인해 약물의 이상적인 타깃이 됩니다.
전체 길이의 완전한 구조를 가진 다중 막관통 타깃 단백질은 매우 중요한 의미가 있습니다. CD20을 예로 들면 연구에 따르면 Ritux*mab은 1차 에피토프 ECL2뿐만 아니라 2차 에피토프 ECL1/ECL2에서도 CD20을 인식하는 것으로 확인되었습니다. 에피토프 ECL1/ECL2는 또한 Ritux*mab의 CDC 효과에 영향을 미칩니다[1]. 그러나 다중막관통 단백질은 복잡한 구조와 다중 소수성 막관통 영역을 가지며 숙주 세포에서의 발현 수준이 극도로 낮아 집니다.
다중 막관통 타깃 단백질 전체 길이 준비하는 어려움을 목표로, ACROBiosystems는 다중 막관통 단백질 타깃의 약물 연구를 촉진하기 위해 다중 막관통 단백질 타깃의 개발 및 생산단계를 더욱 포괄적인 플랫폼 솔루션으로 특별히 구축했습니다. 다양한 응용 시나리오의 요구 사항을 충족하기 위해 CD20, Claudin18.2, CD133, GPRC5D, CXCR4, CCR5CCR8을 포함한 전체 길이의 다중 막관통 단백질을 제공합니다(그림 1).
3대 기술 플랫폼
VLP기술 플랫폼
 VLP Platform
기술 원리

ACROBiosystems는 HEK293 발현 시스템에 기반한 VLP 기술 플랫폼을 특별히 구축했으며, 이 플랫폼은 세포 표면에 완전한 형태의 막 단백질을 직접 응집하고 이러한 복잡한 막 단백질을 항체 면역화 및 스크리닝을 위한 가용성 고농도 단백질로 전환합니다. 준비된 외피 VLP는 고유한 세포막에 올바르게 접힌 다중 막관통 단백질을 표시하여 타깃의 자연적 형태를 인식하는 기능적 항체를 유도하고 스크리닝할 수 있습니다.

ACROBiosystems는VLP 기술 플랫폼에서 일상적으로 생산되는 다중 막관통 단백질을 제공할 뿐만 아니라 맞춤형 서비스도 제공합니다.

독특한 장점
완전한 ECD 에피토프가 있는 전장 막관통단백질
VLP에서 타깃 항원의 풍부함은 과발현 세포보다 더 높습니다.
면역원성을 향상시킬 수 있음
크기는 100-300 nm로 in vivo에서 수지상 세포 및 파지 디스플레이에 가장 적합한 타깃으로 사용할 수 있습니다.
면역/ELISA/SPR/BLI/세포 실험/CAR 양성률 검출에 사용할 수 있습니다.
막 단백질-세제 기술 플랫폼
Detergent Micelle Platform
기술 원리

다중 막관통 단백질의 막관통 구역은 소수성이 높아 일반 완충기에서는 정확한 형태를 유지하기 어려운데 이러한 문제는 세제를 첨가하면 해결할 수 있습니다. ACROBiosystems는 곤충 세포 발현 기술과 포유류 세포 발현 기술을 바탕으로 난해한 약물 타깃 막관통 단백질에 대한 발현 플랫폼 및 정제 플랫폼을 특별히 구축했으며, DDM/CHS(Cat. No. DC-11) 등 일반적으로 사용되는 세제를 선별해 왔으며 다중 막관통 단백질의 수용성을 크게 증가시키고 용액에서 자연스럽고 올바른 형태를 형성하는 데 도움이 되였습니다.

독특한 장점
다중 막관통 단백질은 완전 입체형태를 가지고 있습니다.
정확히 정량 가능
면역/ELISA/SPR/BLI 에 적용 가능
Nanodisc기술 플랫폼
Nanodisc Platform
기술 원리

"Nanodisc"의 인지질층 구조는 MSP(membrane scaffold protein)와 인지질 분자로 구성된 인지질 이중막 구조로, 막관통 단백질은 세제를 제거한 후 Nanodisc의 특수한 구조에 통합될 수 있으며 생물학적 활성을 유지하여 좋은 수용성이 있어서 더 널리 사용됩니다.

ACROBiosystems의 연구 개발팀은 지속적인 최적화 개선을 거쳐 산업화된 scale-up 생산에 적합한 Nanodisc 조립 공정을 성공적으로 탐색하여 막관통 단백질 Nanodisc의 장기적이고 안정적인 공급을 실현했습니다.

독특한 장점
전장 막관통 단백질은 자연적인 막환경에 존재하여 생물학적 활성을 유지함
수용성이 좋아,세제가 필요 없음
면역/ELISA/SPR/BLI/세포 실험/CAR 양성률 검출에 사용 가능
제품 리스트
  • VLP

  • 막 단백질-세제

  • Nanodisc

분자제품 번호제품 설명적용 시나리오주문/예매
분자제품 번호제품 설명적용 시나리오주문/예매
분자제품 번호제품 설명적용 시나리오주문/예매
케이스 전시

아래의 ELISA&SPR 데이터는 내부 실험 조작법 참고용으로 무료로 제공되며, Protocol을 클릭하시면 받아 보실 수 있습니다.

Claudin18.2-VLP

전자현미경의 관측을 통하여 정확한 조립을 확보했다
전장 Claudin18.2-VLP(CL2-H52P7)가 올바르게 조립되었는지  전자 현미경으로 확인되었습니다.
Claudin18.2-VLP
ELISA에 의해 높은 생물학적 활성이 검증되었다
ELISA

Immobilized Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No. CL2-H52P7) at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Monoclonal Anti-Chimeric Claudin-18.2 Antibody, Human IgG1 with a linear range of 0.2-3 ng/mL (QC tested).

높은 친화력은 SPR 에 의해 검증되었다
SPR

Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No. CL2-H52P7) captured on CM5 Chip via Anti-Claudin-18.2 antibody can bind Anti-Claudin-18.2 antibody with an affinity constant of 0.374 nM as determined in a SPR assay (Biacore T200) (Routinely tested).

CAR 양성률 검출에 적용

FACS로 검증됩니다. Claudin18.2-CAR-293 세포에 Human Claudin18.2-VLP 단백질(Cat. No. CL2-HF218)과 음성 대조군 단백질(Cat. No. VLP-NF2P4)을 각각 형질감염시켰다. Claudin18.2-VLP 단백질(Cat. No. CL2-HF218)은 Claudin18.2-CAR-293 세포에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여주었습니다.

Good bioactivity validation of CD20-DDM/CHS

2e5 of Anti-Claudin-18.2 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 3 μg/mL of Fluorescent Human Claudin-18.2 Full Length Protein-VLP (Cat. No.CL2-HF218) and negative control protein respectively, FITC signals was used to evaluate the binding activity (Routinely tested).

CD20-DDM/CHS

검증 데이터1
ELISA는 전장 CD20-DDM/CHS(CD0-H52H3)가 0.4-3 ng/mL의 선형 간격으로 리툭시맙(Ritux*mab)에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인했습니다.
Good bioactivity validation of full-length CD20-DDM/CHS

Immobilized Ritux*mab at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS).

검증 데이터2
ELISA는 바이오틴 표지된 전장 CD20-DDM/CHS(CD0-H82E5)가 4-63 ng/mL의 선형 범위로 리툭시맙(Ritux*mab)에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인했습니다.
Good bioactivity validation of CD20-DDM/CHS

Immobilized Ritux*mab at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
                 

검증 데이터3
SPR 친화성 검증 후, 바이오틴 표지된 전장 CD20-DDM/CHS(CD0-H82E5)는 리툭시맙(Ritux*mab)에 특이적으로 결합할 수 있으며, 친화도 상수는 1.73  nM이다.
High affinity validation of CD20-DDM/CHSE

Biotinylated Human CD20, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) captured on Biotin CAP-Series S Sensor Chip can bind Ritux*mab with an affinity constant of 1.73 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore T200).

CD133-Nanodisc

검증 데이터1
전기영동(SDS-PAGE)을 통해 his-tag 전장 CD133-Nanodisc 단백질의 순도가 90% 이상임을 확인했습니다.
Purity greater than 90% by SDS-PAGE

Human CD133 Full Length, His Tag (Nanodisc) ((Cat. No. CD3-H52H1))on SDS-PAGE under reducing (R) condition. The gel was stained overnight with Coomassie Blue. The purity of the protein is greater than 90%.
                  

검증 데이터2
ELISA는 전장 CD133-Nanodisc(CD3-H52H1)가 0.2-4 ng/mL의 선형 범위로 항-인원 CD133(133-3) 단일클론 항체에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인했습니다.
ELISA

Immobilized Human CD133 Full Length, His Tag (Nanodisc) (Cat. No. CD3-H52H1) at 1 μg/mL (100 μL/well) can bind Monoclonal Anti-Human CD133 (133-3) Antibody, Human IgG1 with a linear range of 0.2-4 ng/mL (QC tested).

Questions & Answers
Transmembrane Proteins Platform
Q1:For immunization and antibody screening, which platform should I choose for Claudin18.2?

Our Claudin18.2 has been developed with VLP and DMM/CHS platforms. Both of these versions are suitable for immunization and screening. However, the VLP version may be preferred for improved immunogenicity. For accurate affinity measurements, we recommend using the DDM/CHS version (the detergent version).

Q2:Why do you want to emphasize the importance of full-length protein? After all, antibodies and antigens only bind on the extracellular domain.

Multi-pass transmembrane proteins span the cell membrane multiple times forming multiple extracellular domains. For example, Claudin18.2, CD20, and CD133 have two extracellular loops (ECLs) with each ECL having specific functions and interactions with each other. Full length can ensure that the protein conformation is biologically relevant while enabling the ECL to be completely exposed for improved screening of ideal antibodies. As the figure below illustrates, the full length is active and relevant compared to isolated extracellular domain. It is not the case that ACRO always emphasizes full length proteins, but drug discovery R&D work needs the full-length multi-pass transmembrane proteins. Indeed, when compared, the activity of only the ECL region is worse than that of the full-length protein. ACRO is committed to providing the high quality and relevant products that meet customers' needs.

Structure of Full-length CD20 Protein
Q3:How do you exclude non-specific antibodies for the full-length membrane proteins in VLP and Nanodisc platforms?

The influence of non-specific antibodies cannot be ignored. Using membrane proteins under the VLP and Nanodisc platforms may produce non-specific antibodies. Both of our platforms have corresponding isotype controls for reverse-screening and excluding non-specific antibodies. Membrane protein-VLP has an isotype control product (Cat. No. VLP-NF2P4). Membrane protein-Nanodisc has two isotype control products, one of which is MSP1D1(Cat. No. APO-H51H3) as the isotype control for tag free version. If a biotinylated membrane protein-Nanodisc is used, MSP1D1(Cat. No. APO-H81Q5) can be used as the isotype control.

VLP/Nanodisc isotype control products
Q4:Compared to other platforms, what are the advantages of Nanodiscs?

Nanodisc-membrane proteins are quite different from detergent stabilized membrane proteins. First of all, in principle, Nanodisc-membrane protein are assembled on native membrane-like structures and are completely detergent free. This opens up applications like immunization use for Nanodisc assembled proteins otherwise restricted due to detergent dissolving native cell membrane and causing damage to cells. In addition, the Nanodisc version of membrane proteins are compatible with cell-based assays and CAR expression detections. The Nanodisc platform used by ACRO has been authorized by the patent holder and can be used with confidence during the development process.

Q5:How do you confirm that Claudin18.2-VLP contains the target protein and how do you evaluate its purity? In the EM image on your product page, how do you tell whether the protein is embedded on the VLP particle?

Claudin18.2-VLP is tested and verified by anti-Claudin18.2 specific antibodies. The purity is evaluated by SDS-PAGE/HPLC/DLS/SEM. The conventional negative dye EM cannot see whether Claudin18.2 is on the VLP due to its low resolution. Binding activity with anti-Claudin18.2 specific antibodies can confirm the presence of Claudin18.2 on the particles.

Q6:Would VLP-membrane proteins be suitable for lyophilization? Could it be emulsified, and are there any requirements for the type of adjuvant? What are the precautions for using VLP formulated proteins for immunization?

We currently store all VLP formulated products as liquids at -70°C and ship on dry ice. We do store non- enveloped VLP products by freeze-drying. VLP immunization mainly requires attention to the choice of adjuvant dose, because VLP itself can enhance immunogenicity, which is not the case for conventional protein products.

Q7:You also have VLP versions of CD24 and PD-1. Are they the same as Claudin18.2? What is the difference between enveloped VLP and non-enveloped VLP?

CD24 and PD-1 are soluble proteins. They are not multi-pass transmembrane proteins, so non-enveloped VLPs are used. While multi-transmembrane proteins have hydrophobic transmembrane regions and need to be embedded on the membrane of the enveloped VLPs. The difference between VLP and enveloped VLP is whether there is a phospholipid bilayer membrane on the surface of the VLP.

Q8:How long is the lead time for customized full-length membrane protein?

If customized, the membrane protein in VLP format is expected to take 6-8 weeks.  The DDM/CHS version requires expression and purification conditions optimization of the target multi-pass transmembrane protein and detergent screening, so the development cycle is longer lasting more than 8 weeks. The customized Nanodisc version of membrane protein requires an additional 4 weeks on top of the DDM/CHS development time.

참고 논문

Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody Ritux*mab.

The role of CD133 in cancer: a concise review.

  • Authors: Paige M. Glumac , Aaron M. LeBeau.

  • Journal: Glumac and LeBeau Clin Trans Med

  • Download Full Article

Structural and Molecular Interactions of CCR5 Inhibitors with CCR5.

  • Authors: Kenji Maeda, Debananda Das et al.

  • Journal: Journal of Biological Chemistry

  • Download Full Article

Role of Conserved Disulfide Bridges and Aromatic Residues in Extracellular Loop 2 of Chemokine Receptor CCR8 for Chemokine and Small Molecule Binding.

  • Authors: Line Barington, Pia C. Rummel, et al.

  • Journal: Journal of Biological Chemistry

  • Download Full Article

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