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> HEK293에 의해 발현되는 전장 CD20 단백질
B 세포 표면 항원으로서 CD20은 pre-B 세포 부터 성숙한 B 세포까지 발현되지만 전구체 B 세포 및 성숙한 형질 세포에서는 발현되지 않습니다. CD20은 B 세포 유래 림프종, 백혈병 및 기타 종양 세포, 염증 및 면역 관련 질병에 관여하는 B 세포에서 발현되므로림프종, 백혈병 및 특정 자가 면역 질환의 치료 타깃이 되기도 합니다.
CD20을 타깃으로 하는 항체 약물은 3세대 혁신을 거쳤습니다. 일세대는 Ritux*mab(리툭시맙)으로 대표되는 인간-마우스 키메라 항체입니다. 인간화의 정도가 높지 않고 일부 환자는 약물 내성 또는 부작용이 발생할 수 있습니다. 이 세대는Ofatumumab으로 대표되는 인간화 변형 항체입니다. 면역원성은 감소하고 부작용을 감소하지만 항체의 특이성 및 항원 결합 친화도는 어느 정도 감소되였습니다. 삼 세대는 Obinutuzumab(오비누투주맙)으로 대표되는 Fc 단편 당화 항체로 항체의 특이성과 항원에 대한 결합 친화도를 높여 ADCC 및 ADCP 효과를 높일 수 있습니다. 단일 클론 항체 약물 분야에 국한되지 않고, CD20은 CD3 및 기타 타깃에 결합함으로써 이중 특이적 항체의 개발을 통해 B 세포에 T 세포를 모집할 수 있고, 이로써 B 세포에 대한 T 세포의 사멸 효과를 달성할 수 있습니다.
CD20을 타깃으로 하는 항체 약물을 개발하기 위해서는 고품질 항원이 필수적입니다. 2020년 2월 20일 Genentech는 Science에서 Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody Ritux*mab를 발표하여 전장 CD20 단백질 및 CD20 단백질과 Ritux*mab Fabs 복합체의 3차원 구조를 획기적으로 분석하였습니다.
이 기사는 Ritux*mab이 CD20에 대한 1차 에피토프 ECL2를 인식할 뿐만 아니라 2차 에피토프 ECL1/ECL2도 인식한다는 것을 확인합니다. SPR에 의해 확인된 Ritux*mab과 전장 CD20 단백질 및 ECL2 폴리펩티드 에피토프 간의 친화도 차이는 2차 에피토프 ECL1/ECL2가 리툭시맙과 CD20의 친화도에 영향을 미칠 것임을 나타냅니다. 또한 이 논문은 2차 에피토프 ECL1/ECL2가 Ritux*mab의 CDC 효과에도 영향을 미칠 것으로 밝혀 완전한 구조를 갖는 전장 CD20 단백질의 중요성을 드러냈습니다. (논문의 전체 텍스트는 페이지 끝에서 다운로드할 수 있습니다)
전장 CD20 단백질 발현의 어려움과 불안정한 활성 등의 요인으로 인해 현재 시장에서 항체 활성 분석에 적합한 CD20 단백질을 찾기가 어렵습니다. ACROBiosystems는 비표지 및 비오틴 표지 Nanodisc, DDM 및 VLP 버전을 포함하여 HEK293에 의해 발현되는 4-패스 막관통 전장 CD20 단백질을 개발하기 위해 독특한 디자인을 채택했습니다. 전장 CD20 단백질은 small loop와 big loop를 모두 가지고 있으며 완전한 자연적 올바른 구조를 가지며 면역 분석/ELISA/SPR/BLI/FACS에 사용할 수 있습니다. 전장CD20 단백질에 대한 리툭시맙과 오파투무맙의 결합 활성을 확인하였으며, 전장 CD20 단백질은 나노몰(nmol) 등급 고친화도가 나타났습니다. 프로토콜은 무료로 제공합니다.
DDM은 지질막을 분해하여 막단백질을 방출할 수 있는 비이온형 세제로서 용액에서 막이 제거된 상태에서 막단백질에 소수성 환경을 제공하여 막단백질의 소수성 다중 막관통 구조를 유지 및 보호합니다. 그러나 DDM의 존재는 세포막의 구조를 파괴할 수 있으므로 일반적으로 세포 실험에 권장하지 않습니다.
이중막 구조로, 막단백 을 Nanodisc의 특수한 구조에 통합하여 생물학적 활성을 유지하고 물에 대한 용해도가 우수하여 널리 사용됩니다. ACROBiosystems에서 사용하는 Nanodisc 기술은 특허권자의 승인을 받았으며, 바이오의약품 R&D 기업들은 R&D 과정에서 안심하게 사용할 수 있습니다.
VLP(Virus like particles) 기술 플랫폼은 세포 표면에 완전한 형태의 막 단백질을 직접 응집시켜 이러한 복잡한 막 단백질을 항체 면역화 및 스크리닝을 위한 가용성 고농도 단백질로 전환합니다. 준비된 포막 VLP는 고유한 세포막에 올바르게 접힌 다중 막관통 단백질을 표시하므로 타깃의 자연적 형태를 인식하는 기능적 항체를 유도하고 스크리닝할 수 있습니다.
A) HEK293 Cell (Full Length)
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
B) E.coli (Extracellular)
Immobilized RTX at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20, TrxA Tag, His Tag (E.coli) with a linear range of 78-2500 ng/mL.
2e5 of CD20-CAR-293 cells transfected with anti-CD20-scFv were stained with 100 μL of 3 μg/mL of Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (Cat. No. CD0-H82E3) and negative control protein respectively, washed and then followed by PE-SA and analyzed with FACS (QC tested).
2e5 of CD20-CAR-293 cells transfected with anti-CD20-scFv were stained with 100 μL of 3 μg/mL of Human CD20 / MS4A1 Full Length Protein, His Tag (Nanodisc) (HEK293)(Cat. No. CD0-H52H1) and negative control protein respectively, washed and then followed by PE anti-His antibody and analyzed with FACS (QC tested).
Immobilized RTX at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (Cat. No. CD0-H82E3) with a linear range of 0.008-0.125 μg/mL
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag (Cat. No. CD0-H52H1) with a linear range of 1-63 ng/mL
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Immobilized anti-CD20 antibody at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Immobilized anti-CD20 antibody at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-6 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Biotinylated Human CD20, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) captured on Biotin CAP-Series S Sensor Chip can bind RTX with an affinity constant of 1.73 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore T200).
Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) captured on CM5 chip via Anti-human IgG Fc antibodies surface can bind RTX with an affinity constant of 6.21 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore 8K).
Authors: Lionel Rougé et al.
Journal: Science.aaz9356
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