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> HEK293에 의해 발현되는 전장 CD20 단백질
B 세포 표면 항원으로서 CD20은 pre-B 세포 부터 성숙한 B 세포까지 발현되지만 전구체 B 세포 및 성숙한 형질 세포에서는 발현되지 않습니다. CD20은 B 세포 유래 림프종, 백혈병 및 기타 종양 세포, 염증 및 면역 관련 질병에 관여하는 B 세포에서 발현되므로림프종, 백혈병 및 특정 자가 면역 질환의 치료 타깃이 되기도 합니다.
CD20을 타깃으로 하는 항체 약물은 3세대 혁신을 거쳤습니다. 일세대는 Ritux*mab(리툭시맙)으로 대표되는 인간-마우스 키메라 항체입니다. 인간화의 정도가 높지 않고 일부 환자는 약물 내성 또는 부작용이 발생할 수 있습니다. 이 세대는Ofatumumab으로 대표되는 인간화 변형 항체입니다. 면역원성은 감소하고 부작용을 감소하지만 항체의 특이성 및 항원 결합 친화도는 어느 정도 감소되였습니다. 삼 세대는 Obinutuzumab(오비누투주맙)으로 대표되는 Fc 단편 당화 항체로 항체의 특이성과 항원에 대한 결합 친화도를 높여 ADCC 및 ADCP 효과를 높일 수 있습니다. 단일 클론 항체 약물 분야에 국한되지 않고, CD20은 CD3 및 기타 타깃에 결합함으로써 이중 특이적 항체의 개발을 통해 B 세포에 T 세포를 모집할 수 있고, 이로써 B 세포에 대한 T 세포의 사멸 효과를 달성할 수 있습니다.
CD20을 타깃으로 하는 항체 약물을 개발하기 위해서는 고품질 항원이 필수적입니다. 2020년 2월 20일 Genentech는 Science에서 Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody Ritux*mab를 발표하여 전장 CD20 단백질 및 CD20 단백질과 Ritux*mab Fabs 복합체의 3차원 구조를 획기적으로 분석하였습니다.
이 기사는 Ritux*mab이 CD20에 대한 1차 에피토프 ECL2를 인식할 뿐만 아니라 2차 에피토프 ECL1/ECL2도 인식한다는 것을 확인합니다. SPR에 의해 확인된 Ritux*mab과 전장 CD20 단백질 및 ECL2 폴리펩티드 에피토프 간의 친화도 차이는 2차 에피토프 ECL1/ECL2가 리툭시맙과 CD20의 친화도에 영향을 미칠 것임을 나타냅니다. 또한 이 논문은 2차 에피토프 ECL1/ECL2가 Ritux*mab의 CDC 효과에도 영향을 미칠 것으로 밝혀 완전한 구조를 갖는 전장 CD20 단백질의 중요성을 드러냈습니다. (논문의 전체 텍스트는 페이지 끝에서 다운로드할 수 있습니다)
전장 CD20 단백질 발현의 어려움과 불안정한 활성 등의 요인으로 인해 현재 시장에서 항체 활성 분석에 적합한 CD20 단백질을 찾기가 어렵습니다. ACROBiosystems는 비표지 및 비오틴 표지 Nanodisc, DDM 및 VLP 버전을 포함하여 HEK293에 의해 발현되는 4-패스 막관통 전장 CD20 단백질을 개발하기 위해 독특한 디자인을 채택했습니다. 전장 CD20 단백질은 small loop와 big loop를 모두 가지고 있으며 완전한 자연적 올바른 구조를 가지며 면역 분석/ELISA/SPR/BLI/FACS에 사용할 수 있습니다. 전장CD20 단백질에 대한 리툭시맙과 오파투무맙의 결합 활성을 확인하였으며, 전장 CD20 단백질은 나노몰(nmol) 등급 고친화도가 나타났습니다. 프로토콜은 무료로 제공합니다.
Detergent can disintegrate the lipid membrane to release the membrane protein and provide a hydrophobic environment, maintain and protect the hydrophobic transmembrane structure of membrane proteins. ACROBiosystems has screened DDM/CHS (Cat. No. DC-11) from commonly used detergents, to increase solubility and ensure native fold of this protein in vitro.
이중막 구조로, 막단백 을 Nanodisc의 특수한 구조에 통합하여 생물학적 활성을 유지하고 물에 대한 용해도가 우수하여 널리 사용됩니다. ACROBiosystems에서 사용하는 Nanodisc 기술은 특허권자의 승인을 받았으며, 바이오의약품 R&D 기업들은 R&D 과정에서 안심하게 사용할 수 있습니다.
VLP(Virus like particles) 기술 플랫폼은 세포 표면에 완전한 형태의 막 단백질을 직접 응집시켜 이러한 복잡한 막 단백질을 항체 면역화 및 스크리닝을 위한 가용성 고농도 단백질로 전환합니다. 준비된 포막 VLP는 고유한 세포막에 올바르게 접힌 다중 막관통 단백질을 표시하므로 타깃의 자연적 형태를 인식하는 기능적 항체를 유도하고 스크리닝할 수 있습니다.
막 단백질-세제
Nanodisc
VLP
A) HEK293 Cell (Full Length)
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
B) E.coli (Extracellular)
Immobilized RTX at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20, TrxA Tag, His Tag (E.coli) with a linear range of 78-2500 ng/mL.
2e5 of CD20-CAR-293 cells transfected with anti-CD20-scFv were stained with 100 μL of 3 μg/mL of Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (Cat. No. CD0-H82E3) and negative control protein respectively, washed and then followed by PE-SA and analyzed with FACS (QC tested).
2e5 of CD20-CAR-293 cells transfected with anti-CD20-scFv were stained with 100 μL of 3 μg/mL of Human CD20 / MS4A1 Full Length Protein, His Tag (Nanodisc) (HEK293)(Cat. No. CD0-H52H1) and negative control protein respectively, washed and then followed by PE anti-His antibody and analyzed with FACS (QC tested).
Immobilized RTX at 5 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (Cat. No. CD0-H82E3) with a linear range of 0.008-0.125 μg/mL
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag (Cat. No. CD0-H52H1) with a linear range of 1-63 ng/mL
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Immobilized anti-CD20 antibody at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Biotinylated Human CD20 Full Length, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) with a linear range of 4-63 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Immobilized RTX at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-3 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Immobilized anti-CD20 antibody at 2 μg/mL (100 μL/well) can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with a linear range of 0.4-6 ng/mL (in presence of DDM and CHS).
Biotinylated Human CD20, His,Avitag (HEK293) (Cat. No. CD0-H82E5) captured on Biotin CAP-Series S Sensor Chip can bind RTX with an affinity constant of 1.73 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore T200).
Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) captured on CM5 chip via Anti-human IgG Fc antibodies surface can bind RTX with an affinity constant of 6.21 nM as determined in a SPR assay (in presence of DDM and CHS) (Biacore 8K).
Authors: Lionel Rougé et al.
Journal: Science.aaz9356
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